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作者: 原创   发布时间: 2018/8/17 12:57:21

 西北农林科技大学学报(自然科学版)网络出版时间:2015-01-05 5种植物油体性质的比较齐玉红a,b,强卫东a,b,王清曼a,b,邹德毅“,卢震,郭咏昕2,官丽莉2,杜林娜2,杨晶2(吉林农业大学a生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,b生命科学学院,吉林长春130118)目的对5种植物油体的大小、结构及稳定性进行考察,为选择优质的植物油体奠定基础。方法利用PBS作为缓冲液,采用梯度离心法,提取水稻、亚麻芥、黄豆、黑豆和红花5种植物的油体,对这5种油体的外观进行观察;在倒置显微镜(10倍目镜X40倍物镜)下对5种植物油体的显微结构进行考察;用Mastersizer 2000激光粒度仪测定5种植物油体的粒径,同时比较于4 C放置15d后5种油体的粒径变化情况;通过SDS-PAGE电泳明确5种植物油体蛋白的分布情况。结果与其他植物油体相比,红花油体色泽洁白、透亮,分布均匀,粒径呈单一峰型,且峰型平滑。红花油体粒径为0.411.0 m,多数集中在1.752.05 m,水稻、亚麻芥、黄豆、黑豆油体粒径分别为0.512.0,0.311.0,0.413.0,0.413.0m.在4C放置15d后,5种植物油体的粒径增大,油体中均有杂峰出现,峰型不规则。SDS-PAGE电泳检测结果显示,5种植物油体相关蛋白主要分布在20.144.3ku.结论红花油体较其他植物油体结构规则,分散均匀,应用前景广阔。

油体;显微结构;粒径国家大学生创新创业训练项目(201310193050,201410193037);国家教育部博士点基金-青年教师基金项目(20122223120002);吉林省教育厅项目(201458)吉林省中医药管理局项目齐玉红(1990?),女,甘肃白银人,主要从事生物制药研究。E-mail:1345570232qq.?),女,吉林省吉林市人,副研究员,博士,主要从事植物生物反应器研究。

大部分植物种子都将脂类作为主要储藏物质,而这些脂类主要储存在某种亚细胞器颗粒中,分散成许多小的相对稳定的亚细胞微滴,这些亚细胞微滴称为油体(Oilbody)或拟脂体(Lipidbodies),也有的称为油质体(Oleosome)。油体由单层的磷脂膜、三酰甘油(TAG)以及表面镶嵌的油体蛋白、钙结合蛋白、固醇结合蛋白组成。其中储存在油体内部的TAG可为种子萌发提供能量4.油体蛋白是油体表面主要的膜蛋白,为碱性疏水蛋白,由3部分组成,包括亲脂的N端、C端和中间的疏水区域。N端和C端镶嵌在油体表面,暴露在细胞质中;中间的疏水区域通过磷脂膜进入到油体内部。因此,油体会产生电阻和静电排斥,使其能够独立存在。在油体悬浮液中,油体作为独立个体存在,可以作为疫苗、食品、化妆品和个人护理产品的乳化剂。

近20年来,对于油体的研究趋向多样化。最近的研究热点是采用油体构建的植物生物反应器油体表达系统来生产外源蛋白。加拿大Sembicsys公司用植物生物反应器表达了多种药用蛋白,如在红花中表达人胰岛素,且已达到商业化生产水平。

由于植物油体在医药、食品、工业等行业有着极其广泛的用途,其开发越来越受到人们的重视。Deckers等将提取的植物油体应用于食品、药品以及化妆护肤品中。因此,选择优质的植物油体,对于其开发利用具有重要意义。本试验改进了Ten等和acks等提出的植物油体提取方法,利用PBS作为提取缓冲液,从红花、水稻、亚麻芥、黄豆和黑豆5种植物中提取油体,通过显微镜和激光粒度仪,观测不同植物油体的结构和大小,并对这5种植物的油体进行SDS-PAGE电泳检测,确定5种植物油体的蛋白分子质量,以期为筛选优质的植物油体奠定基础。

1材料与方法1.1材料水稻、亚麻芥、黄豆、黑豆和红花5种植物种子由吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心保存。

试验所用化学试剂购自北京化工试剂公司,蛋白Marker和5X上样buffer购自大连宝生物工程有限公司。

1.2方法1.2.1植物油体的提取采用改进了的Tzen等和acks等报道的植物种子油体提取方法梯度离心法进行。将5种植物种子分别浸泡在蒸馏水中(种子与蒸馏水的质量体积比为1:5),4C放置过夜;然后将浸泡好的植物种子置于300L、pH7. 0的PBS缓冲溶液中,用榨汁搅拌机搅拌3min,得到5种植物种子的匀浆液,用3层滤布过滤除去残渣;滤出液于4C、12000g条件下离心30min,收集上层物质;将其重新悬浮于PBS缓冲溶液中,4C、0 000g离心10min,收集上层物质;4°C、8000g离心10min后,使上层物质重新分散在PBS溶液中(pH 7.0),同样条件再离心3次,将得到的上层油体置于4C冰箱中备用。

1.2.2植物油体的显微结构观察分别称取5种植物油体0.5g,加入5mLPBS(pH7.0,10mmol/L)溶液稀释成质量分数10%的油体悬浮液。

将其滴在载玻片上,盖好盖玻片,放置在倒置显微镜(10倍目镜X40倍物镜)下观察植物油体的分布情况。

1.2.3植物油体粒径的测定将1. 2.2中油体悬浮液稀释1000倍,使其达到相应的遮光度,用Mastersizer 2000激光粒度仪于25C下测定油体平均粒径表。,每个样品平行测定3次。

1.2.4植物油体的稳定性测定将1. 2.2中5种植物种子的油体悬浮液于4C放置15d,然后将其稀释1000倍,使其达到相应的遮光度,用Master-sizer 2000激光粒度仪于25C下测定油体的平均粒径表。,每个样品平行测定3次。同时,在倒置显微镜下(10倍目镜X40倍物镜)镜检,观察5种植物油体的聚集情况。

1.2.5植物油体蛋白的SDS-PAGE电泳检测将1.2.1中提取的植物油体0.01g加入1.5mL离心混合均匀,沸水中煮10min,取出冷却至室温后,10000g离心5min,取上清液,每孔加样10uL,进行12%分离胶的SDS-PAGE电泳分离,80V电泳10min,待样品通过浓缩胶后,电压增至120V直至样品到达胶板最下方,结束电泳;然后考马斯亮蓝R250染色2h,用脱色液脱色后,观察结果。

2结果与分析2.1 5种植物油体的外观观察提取的5种植物油体外观,结果见。A 5种植物油体的外观A.水稻;B.亚麻芥;C.黄豆;D.黑豆;E.红花显示,红花油体色泽洁白、透亮,其他植物2.2 5种植物油体的显微结构油体呈白色略带微黄;亚麻芥、红花、黄豆和黑豆种在倒置显微镜下观察5种植物油体的结构,结子的油体提取率较高,而水稻中油体提取率较低。果见。

5种植物油体的显微结构(400X)AE.刚提取的植物油体;A1El.4C放置15d的植物油体;A、A1.水稻;B、B1.亚麻芥;C、C1.黄豆;D、D1.黑豆;E、E1.红花-AE显示,红花油体分散较为均匀,油体均匀;5种植物油体在4C冰箱中放置15d后(-形状更为完整、规则;亚麻芥油体较小,分散也比较A1E1),5种植物油体均发生聚集,大小不均一。

2.3 5种植物油体的粒径由可见,5种植物油体的粒径差距较大,水稻油体分布不是很均匀,检测粒径的峰型出现波动,粒径为0.512. 0pm,多数集中在6.亚麻芥油体的粒径为0.311.0pm,多数集中在1.752.25pm;黄豆和黑豆油体的粒径均为0. 13.0pm;红花油体粒径为0.411.0pm,多数集中在1.752.05pm,呈单峰型,且峰型平滑。5种植物油体在4C冰箱中放置15d后,其油滴之间发生聚集,粒径增大;5种植物油体均有杂峰出现,且峰型不规则。

5种植物油体的粒径分布AE.刚提取的植物油体;A1El. 4C放置15d的植物油体;A、A1.水稻;B、B1.亚麻芥;C、C1.黄豆;D、D1.黑豆;E、E1.红花2.4 5种植物油体的SDS-PAGE检测5种植物油体蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果见。

5种植物油体蛋白的SDS-PAGE电泳分析M.蛋白Marker;。水稻;2.亚麻芥;3.黄豆;4.黑豆;5.红花Fig.从可以看出,5种植物油体的相关蛋白组成均不相同,其中水稻油体中蛋白分子质量为20.129. 0ku;亚麻芥油体中蛋白分子质量为20.135.0ku;黄豆和黑豆油体中相关蛋白较多,其分子质量为20. 197.0ku;红花油体中的蛋白分子质量主要集中在20.144.3ku. 3讨论油体是生物体内最小的细胞器,主要以颗粒状的形式存在于植物种子中,主要功能是储藏脂类,为种子萌发和幼苗生长提供碳源和能源。近年来,植物油体得到越来越多的关注,目前研究较多的植物油体如大豆、油菜、亚麻芥等,已经被开发成油体乳液,应用在个人护理产品中。据报道,利用高碱性物质提取大豆油体,可以得到纯净的、杂蛋白少的油体,但是在一定程度上会改变油体成分。因此,本研究选用PBS法提取油体,比较了5种植物油体的结构及粒径,考察了5种植物油体的稳定性和油体蛋白的分子质量。本研究结果显示,与其他植物油体相比,红花油体色泽洁白,油体规则,分散均匀,说明红花油体更适用于油体产品的开发;种植物油体在4C冰箱中放置15d后,其油滴之间均发生聚集,粒径增大,这可能是由于油体表面蛋白被中和的负电荷越多,油体表面所带电荷量越少,油体中油滴之间的静电斥力也越小,因此油滴和油滴之间发生聚集现象,从而造成油体平均粒径的增大。当植物油体脱离种子独立存在时,容易发生聚集,造成植物油体体外的不稳定表现。因此,本研究还将继续探索油体的最佳稳定剂和保存条件,使其在一定的环境条件下能够稳定存在。

仇健,谭晓凤。植物种子油体及相关蛋白研究综述。中南林学院学报,2005,5(4):赵传志,卢金,东苏磊。以油体作为生物反应器的研究进展。生物技术通报,2008(2)曹艳芸,陈业明,华欲飞。高碱性提取的大豆油体的成分变化

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